细胞蛋白提取方案

## 细胞蛋白提取实验方案

### (一) 蛋白提取 —— 冰上进行

1. **PBS 冲洗**：细胞冲洗 2~3 次。
2. **初步裂解**：六孔板中加入 $200\mu l$ RIPA 裂解液（内含 100:1 的 PmfS 蛋白酶抑制剂），冰上裂解 3~5 min。期间可反复摇晃，使试剂与细胞充分接触。
3. **刮取细胞**：用 $1ml$ 枪头反过来刮细胞，此时液体呈粘稠鼻涕状。
4. **二次裂解**：将液体收集至 $1.5ml$ EP 管中，冰上裂解 10min~20min，期间可震荡辅助裂解。
5. **离心**：$4^\circ\text{C}$，12000 rpm，离心 10 min。
6. **收集上清**：吸取上清 $150\mu l$ 左右至全新 EP 管中。
* *注：蛋白沉淀可能不明显，吸取时只要不吸到底部即可。*

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### (二) 测浓度 (BCA法) —— 可选做

#### 1. 配液

* **样品液**（以稀释 5 倍为例）：$20\mu l$ 上清 + $80\mu l$ RIPA 或 PBS。
* **蛋白标准液** ($125mg/ml$)：$20\mu l$ 标准液 + $980\mu l$ PBS $\rightarrow$ 最终浓度 $0.5mg/ml$。
* **BCA 工作液**：$300\mu l$ BCA-A 液 + $6\mu l$ BCA-B 液。

#### 2. 加样 (96孔板)

* **标准孔 (8个)**：
1. 每孔加入 $200\mu l$ BCA 工作液。
2. 按梯度加入标准品与 PBS（单位：$\mu l$）：
| 标准品量 | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 16 | 20 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| **PBS量** | 20 | 19 | 18 | 16 | 12 | 8 | 4 | 0 |

* **样品孔 (3复孔)**：
1. 每孔加入 $200\mu l$ BCA 工作液。
2. 每孔加入 $20\mu l$ 样品液。

#### 3. 反应与检测

1. **孵育**：避光，$37^\circ\text{C}$ 孵育 30 min。
2. **检测**：分光光度计检测 562 nm 的 OD 值，记录数据。
3. **数据分析**：使用 Excel 绘图，以标准品浓度为 $y$，OD 值为 $x$ 绘制散点图。
* 拟合标准曲线 $y = bx + c$。
* 计算 $R^2$ (相关系数)，$R^2 > 0.99$ 即可用标曲。
4. **浓度计算**：代入样品 OD 值，得出稀释后的样品浓度。
* **实际浓度 = 稀释后浓度 × 稀释倍数**。

#### P.S. 经验笔记

* 蛋白浓度处于 $1mg/ml \sim 5mg/ml$ 为最佳，浓度过高可稍作稀释。
* BCA 定量主要是为了后续 WB 实验调节上样量使内参对齐。但个人习惯若不设定量，可直接跑 WB，根据内参条带的粗细调整下次上样量。

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### (三) 蛋白变性

1. **比例**：按 **蛋白上清 : Loading Buffer = 4 : 1** 的比例加入 Loading Buffer，混匀。
2. **加热**：$95^\circ\text{C}$ 变性 3~5 min（不能过久，避免蛋白凝固）。
3. **分装保存**：分装入 EP 管，$-20^\circ\text{C}$ 储存（可避免反复冻融影响蛋白质量）。